細菌性角膜炎可導致角膜穿孔，甚至失明，通常是多藥耐藥細菌感染的結果。綠膿桿菌對抗生素具有天然耐藥性，很難用臨床可用的抗生素清除，生成的生物膜是細菌性角膜炎的主要病因。抗菌光動力療法（aPDT）是一種很有前途的抗耐藥細菌的殺菌方法，然而，使用廣譜aPDT殺滅細菌可能會導致正常細胞的微生物群失衡，造成嚴重的副作用。綠膿桿菌含有兩種凝集素，Lec A（d-半乳糖特异性）和LecB（l-海藻糖特异性），它們在綠膿桿菌的宿主識別、組織粘附和生物被膜形成中發揮重要作用。針對Lec A是一種很有前景的方法來對抗綠膿桿菌感染，而不會引起耐藥性、細菌突變或損害正常宿主哺乳動物細胞。
北京化工大學徐福建教授、俞丙然副教授以及北京協和醫院睢瑞芳教授團隊共同設計並合成了具有可控結構和分子量的二嵌段共聚物PαGal50-b-PGRB20，該聚合物能有效分散生物膜，並通過與胞外聚合物中的Lec A結合，選擇性殺滅生物膜內的綠膿桿菌，並作用於廣譜aPDT引起的低光毒性綠膿桿菌膜上。PαGal50-b-PGRB20通過破壞DNA、RNA、蛋白質和細胞膜具有殺菌活性。綠膿桿菌感染角膜炎模型的體內研究表明，PαGal50-b-PGRB20具有改善、恢復角膜的潜力。這項研究提供了一種專用的抗菌材料，可以優先殺死耐多種藥物的綠膿桿菌而不是正常細胞和其他細菌，以題為“Bacteria-Targeting Photodynamic Nanoassemblies for EfficientTreatment of Multidrug-Resistant Biofilm Infected Keratitis”發表在最新一期的《Advanced Functional Materials》上。
圖1：細菌靶向納米組裝體合成及其應用示意圖。
【PαGal50-b-PGRBn的合成與表徵】
通過可逆加成斷裂鏈轉移（RAFT）聚合和開環反應得到了二嵌段共聚物PαGal50-b-PGRBn。核磁共振氫譜顯示了αAcGEMA的典型化學位移。PαGal50-b-PGRBn在疏水相互作用驅動下自發組裝成膠束，膠束呈球形，乾燥狀態下樣品的實際尺寸略小於流體動力直徑。PαGal50-b-PGRB20具有螢光性質，最大發射波長為610 nm。螢光法觀察PαGal50-b-PGRB20在細胞內的分佈。細菌內部可見黃色螢光（紅綠兩色合併），表明PαGal50-b-PGRB20可以進入細菌細胞質。流式細胞術發現PαGal50-b-PGRB20與胰蛋白酶處理後綠膿桿菌的結合率顯著低於PαGal50-b-PGRB20直接處理的菌群。由此可見，PαGal50-b-PGRBn與綠膿桿菌的結合是由於α-d-半乳糖與Lec A的特异性結合所致。
圖2:PαGal50-b-PGRB20部分表徵圖
【活性氧的檢測與抗菌機理】
高濃度的活性氧可以殺死細菌，引入四碘四氯螢光素（RB）作為光敏劑，PαGal50-b-PGRBn在光照下產生活性氧（ROS），激發抗菌活性。在沒有照射的情况下，經PαGal50-b-PGRB20處理的菌落在瓊脂平板上生長良好，表明ROS是抗菌PDT的關鍵因素。電子自旋共振（ESR）科技檢測了1O2和•OH的生成。PαGal50-b-PGRB20改變了綠膿桿菌胞內膜在光照下的滲透性，這可能是由於1O2與胞內不飽和脂質的反應導致胞內膜滲透性的改變。收集PαGal50-b-PGRB20光照處理後綠膿桿菌的基因組DNA和蛋白質，與對照組相比，選取的DNA和蛋白質的條帶變弱，表明綠膿桿菌內的ROS對DNA和蛋白質造成了損傷。對毒力基因進行RT-qPCR分析，PαGal50-b-PGRB20組各毒力因數基因表達量均低於對照組，說明PαGal50-b-PGRB20在光照下可以下調綠膿桿菌毒力因數。
圖3：活性氧檢測與抗菌表徵
【PαGal50-b-PGRBn的選擇抗菌性】
探索了PαGal50-b-PGRB20對LB培養基的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。常規抗菌藥物對綠膿桿菌的MIC均高於其中斷點，表明常規抗菌藥物在臨床上已失效。PαGal50-b-PGRB20的MIC和MBC分別為64µg mL−1和128µgmL−1，表明PαGal50-b-PGRB20對綠膿桿菌具有殺菌活性而不是抑制活性。探究了PαGal50-b-PGRB20是否能够殺死研究中常用的革蘭氏陰性菌KR-K12和一種重要的病原體鮑曼不耐菌。結果表示，輻照對PαGal50-b-PGRB20的KR-K12和鮑曼不耐菌的殺傷作用可以忽略不計，進一步證明PαGal50-b-PGRB20與綠膿桿菌的絡合是由於α-d-半乳糖與Lec A的特异性結合。
圖4:PαGal50-b-PGRBn的選擇抗菌性表徵
【體內綠膿桿菌生物膜感染角膜炎的有效治療】
基於體外抗菌和生物相容性結果，建立綠膿桿菌感染角膜實驗模型，探討PαGal50-b-PGRB20的治療效果。角膜螢光素染色檢測PαGal50-b-PGRB20在光照下是否會損傷角膜上皮。兩組實驗兔的螢光强度與對照組兔相似，說明PαGal50-b-PGRB20在光照下不會損傷角膜上皮。兔綠膿桿菌感染角膜炎後，治療組和未治療組均觀察到角膜浸潤伴化膿性分泌物、角膜水腫、混和充血及新生血管形成，而未治療組的症狀更為嚴重。未治療組於第7天觀察到角膜潰瘍。第14天，未治療組出現角膜葡萄膜瘤，且角膜白斑和新生血管的嚴重程度高於PαGal50-b-PGRB20組。PαGal50-b-PGRB20組幾乎沒有菌落，而未處理組仍有菌落出現。與治療組相比，未處理組IL-8和VEGF濃度明顯升高。這表明未經治療的組有更嚴重的炎症反應。
圖5：綠膿桿菌感染角膜炎實驗模型治療表徵
【小結】
綜上所述，該研究成功合成了一系列結構可控、分子量合適的靶向雙嵌段共聚物PαGal50-b-PGRBn，能特异性結合生物膜基質和綠膿桿菌中的Lec A，在不引起細菌突變或破壞正常宿主哺乳動物細胞的情况下，解决了綠膿桿菌形成的生物膜，並在光照射下產生ROS殺死綠膿桿菌。體內研究進一步證明PαGal50-b-PGRB20可顯著消除綠膿桿菌生物膜，進而促進綠膿桿菌生物膜感染角膜炎的恢復。該研究為設計和合成安全有效的抗菌材料對抗綠膿桿菌生物被膜感染提供了一種潜在的方法。